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反相高效液相色譜法測(cè)定尿液4種腎病標(biāo)志物
作者：孔宇，趙永席，王波，吳紅，馬國(guó)營(yíng)
【關(guān)鍵詞】 糖尿病腎病
Reversedphase high performance liquid chromatography assay for determining 4 kinds of markers of diabetic nephropathy in urine
【Abstract】 AIM: To establish a new reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method for assay 4 kinds of nonproteinnitrogen markers of human diabetic nephropathy (DN), creatine (Cr), creatinine (Cn), urea (U) and uric acid (Ua) in DN patients urines. METHODS: The urine samples were assayed by RPHPLC on C18 column (200 mm×4.6 mm, id 5 μm) at the ambient temperature and a wave length of 200 nm, using a 10 mmol/L pH 6.86 phosphate buffer ［consisted 30%(V/V) methanol］ as mobile phase with the flow rate of 0.9 mL/min. RESULTS: Baseline separation of the urine could be easily achieved in 5 min after a simple sample preparation. The method also displayed a high reproducibility (RSD values of retention time and peak area were no more than 3%) and the calibration curves showed good linearities in the range of 5-300 μmol/L, 10-200 μmol/L, 1-30 μmol/L, 10-1500 μmol/L for Cr, Cn, U and Ua respectively. CONCLUSION: This method has great potential for routine assay of clinical urine samples and monitoring DN early.
【Keywords】 reversed high performance liquid chromatography; diabetic nephropathy; nonprotein nitrogen; urine
【摘要】 目的：建立糖尿病患者尿液中與腎病相關(guān)的非蛋白氮代謝產(chǎn)物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)的反相高效液相色譜分離分析方法. 方法：采用Agilent C18（200 mm×4.6 mm, 內(nèi)徑5 μm）色譜柱，流動(dòng)相含30％(體積比)甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸緩沖溶液，流速0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，柱溫為室溫. 結(jié)果：在5 min內(nèi)可對(duì)患者尿液中上述4種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，樣品前處理簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性較好(遷移時(shí)間和峰面積的RSD均≤3%)，線性范圍較寬（肌酸：5~300 μmol/L, 肌酐：10~200 μmol/L, 尿素：1~30 mmol/L, 尿酸：10~1500 μmol/L）. 結(jié)論：此法完全適用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測(cè).
【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜；糖尿病腎病；非蛋白氮；尿樣
0引言
糖尿病并發(fā)腎病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者致死的重要原因之一，已引起了人們的廣泛關(guān)注. 非蛋白氮代謝產(chǎn)物如肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿素(urea, U)和尿酸(uric acid, Ua)即是與DN相關(guān)的幾種物質(zhì). 已報(bào)道的有關(guān)這些物質(zhì)的分離分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色譜法［3-6］、毛細(xì)管電泳法［7-9］等. 其中比色法和酶法通常只能測(cè)定單一的物質(zhì)，而且尿液中的一些內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾；液相色譜法則多集中在對(duì)某一種或部分物質(zhì)的測(cè)定上；毛細(xì)管電泳測(cè)定這些標(biāo)志物重現(xiàn)性有待于提高. 我們運(yùn)用反相高效液相色譜法，對(duì)DN患者尿液中與DN相關(guān)的Cr, Cn, U和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物進(jìn)行同時(shí)分離檢測(cè). 同時(shí)測(cè)定尿液中的4種物質(zhì)目前還未見(jiàn)報(bào)道. 此法具有快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，完全可運(yùn)用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測(cè).
1和方法
1.1材料Agilent 1100液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Cr，Cn，Ua均購(gòu)自Sigma公司（USA，Sigma）；甲醇為色譜純?cè)噭ㄌ旖虻诙瘜W(xué)試劑廠）；其余試劑均為分析純，水為二次重蒸水.
1.2方法
1.2.1色譜條件色譜柱為Agilent C18柱（200 mm×4.6 mm,內(nèi)徑5 μm），流動(dòng)相含體積比為30%的甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸緩沖溶液，等度洗脫，流速0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10 μL.
1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置和尿樣的處理方法Cr, Cn和U標(biāo)準(zhǔn)溶液均使用二次重蒸水配置成一定的濃度. Ua溶液的配置方法如下：取30 mg磷酸鉀，溶解在40 mL重蒸水中，加熱至60℃，使其完全溶解，精確稱取Ua 28 mg,溶解于熱磷酸鉀溶液中，冷卻至室溫，移入100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，貯存在棕色瓶中保存. 尿液樣品的處理方法：取新鮮的尿液用水稀釋1倍后待用. 所有溶液每周更換1次，使用前均過(guò)0.45 μm的水相膜后再用于色譜分析.
2結(jié)果
2.1色譜條件的優(yōu)化固定其它色譜條件不變，分別改變緩沖液的pH值、流動(dòng)相（pH 6.86）中甲醇比例、流動(dòng)相中緩沖液濃度和流動(dòng)相的流速，考察了其對(duì)4種物質(zhì)分離的影響. 四種物質(zhì)的分離隨pH、甲醇比例、磷酸緩沖液濃度和流動(dòng)相的流速的變化情況分別如圖1，2所示.
A：流動(dòng)相pH；B：甲醇比例.
圖1流動(dòng)相pH和甲醇比例對(duì)幾種標(biāo)志物保留時(shí)間的影響（略）
A：磷酸緩沖液濃度；B：流速. R12: U和Cr之間的分離度; R23: Cr和Ua之間的分離度; R34: Ua和Cn之間的分離度.
圖2流動(dòng)相中磷酸緩沖液濃度以及流速對(duì)分離的影響（略）
2.2方法重現(xiàn)性在選定的色譜條件下，連續(xù)5次測(cè)定了同一樣品，對(duì)各物質(zhì)的遷移時(shí)間、峰面積和峰高的重現(xiàn)性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明,各物質(zhì)的遷移時(shí)間的變化很小（保留時(shí)間的RSD值見(jiàn)表1），方法的重現(xiàn)性較好.
2.3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率以及最低檢測(cè)限配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，將所測(cè)的峰面積對(duì)物質(zhì)的濃度作回歸分析，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9992；以信噪比(S/N)為3來(lái)測(cè)定檢測(cè)限；添加已知量標(biāo)樣，測(cè)定其含量，計(jì)算方法的回收率(表1).
表1方法的相關(guān)參數(shù)（略）
2.4樣品分析在選定的色譜條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際DN尿樣進(jìn)行了分析，5 min內(nèi)4種物質(zhì)即可達(dá)到完全分離，分離結(jié)果如圖3所示，實(shí)際DN尿樣中的4種物質(zhì)得到了很好的檢出，尿樣里的其他物質(zhì)對(duì)分析無(wú)干擾. 采用此法對(duì)某糖尿病患者以及正常人尿樣中的Cn, Cr, U，Ua分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果糖尿病患者尿樣中Cn, Cr, U，Ua的含量分別為10.3, 0.68, 26.7，2.1 μmol/mL, 正常人尿樣中的Cn, U，Ua的含量分別為7.7, 36.7，1.0 μmol/mL,而Cr未被檢出.
圖3標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和尿樣(B)的色譜圖（略）
3討論
3.1pH對(duì)分離的影響其從圖1A中可以看出，在pH 3.5~7.5范圍內(nèi)U和Cr的出峰時(shí)間和順序幾乎不隨pH的變化而變化；而對(duì)于Cn和Ua來(lái)說(shuō)，其出峰時(shí)間和順序都隨pH的變化而變化，當(dāng)pH接近5.5時(shí)，兩者的出峰時(shí)間近乎相同，得不到分離. 因此，在選擇最佳pH時(shí)，主要考慮Cn和Ua之間的分離度（Rs）以及分析的效率（分析周期短），最終選擇緩沖能力最強(qiáng)，分離度較佳（Rs＝4.1）的pH 6.86為優(yōu)化的分離pH.
3.2流動(dòng)相中甲醇比例的選擇從圖1B中可以看出，隨著流動(dòng)相中甲醇比例的增加，各標(biāo)志物的出峰時(shí)間隨之減少，分離周期大大縮短，但與此同時(shí)各標(biāo)志物間的分離度也相應(yīng)減少，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇的比例大于40％時(shí)，各物質(zhì)幾乎同時(shí)被洗脫出來(lái)，難以達(dá)到分離. 最終選擇流動(dòng)相中甲醇含量為30％為較佳的比例（此時(shí)分析周期較短，各物質(zhì)間分離度均大于2.0）.
3.3流動(dòng)相中緩沖液濃度對(duì)分離的影響從圖2A中可以看出，隨著緩沖液濃度的增加，各標(biāo)志物的峰面積隨之減小. 而緩沖液濃度為5和10 mmol/L時(shí)峰面積比較接近，最終選擇緩沖能力較強(qiáng)的10 mmol/L為最佳緩沖液濃度.
3.4流速的優(yōu)化從圖2B中可以看出，當(dāng)流速?gòu)?.4 mL/min增加到0.9 mL/min時(shí)，各物質(zhì)間的分離度是逐漸增加的，并且分析周期變短；而當(dāng)流速?gòu)?.9 mL/min增加到1.0 mL/min后 ，雖然分析效率有所提高（分離周期從4.8 min減少到4.0 min），但各物質(zhì)間的分離度卻有所減小（此時(shí)的柱壓也過(guò)高：93.1 bar）. 最終選擇0.9 mL/min為最佳流速.
3.5測(cè)定結(jié)果的分析從某糖尿病患者以及正常人尿樣測(cè)定的結(jié)果可以看出，Cn，Cr和Ua在糖尿病患者尿樣中的含量高于正常人（患者尿樣中Cr的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人尿液中Cr的含量）；而患者尿樣中U的含量反而有所降低. 這些都說(shuō)明患者腎功能已經(jīng)出現(xiàn)異常，非蛋白氮代謝產(chǎn)物不能很好的排出體外（對(duì)Cr的排泄率增加，而U排泄率降低），這也從一個(gè)側(cè)面證實(shí)了患者的腎臟已經(jīng)有了一定程度的損壞.
傳統(tǒng)的分析方法的干擾因素較多，分離效率和靈敏度較差，而采用的此法可在5 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定糖尿病腎病尿樣中的Cn, Cr, U和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物. 此方法具有快速、需樣量小、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，完全可運(yùn)用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測(cè).
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