反相高效液相色譜法測定人血漿中單硝酸異山梨酯的濃度

反相高效液相色譜法測定人血漿中單硝酸異山梨酯的濃度

反相高效液相色譜法測定人血漿中單硝酸異山梨酯的濃度

【關鍵詞】 單硝酸異山梨酯；反相高效液相色譜法；血藥濃度

［摘要］ 目的 建立反相高效液相色譜法測定人血漿中單硝酸異山梨酯濃度。方法 采用Ultrasphere C18柱（4.6 mm×250 mm），以甲醇-正己烷-乙腈（90∶6∶4）為流動相，pH 7.4，紫外220 nm檢測，按內(nèi)標法定量。結果 標準曲線在25～1600 μg/L范圍內(nèi)有良好線性，最低檢測濃度為10 μg/L，方法回收率為97.0%～102.1%，日內(nèi)精密度為1.50%～3.10%，日間精密度為3.61%～4.27%。結論 反相高效液相色譜法方法簡單、靈敏、準確，可用于復方單硝酸異山梨酯緩釋制劑生物利用度和藥代動力學的測定，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

　　［關鍵詞］ 單硝酸異山梨酯；反相高效液相色譜法；血藥濃度

　　Reverse phase HPLC for determination of isosorbide mononitrate in human plasma

　　［Key words］ isosorbide mononitrate；RP-HPLC；serum drug level

　　單硝酸異山梨酯（isosorbide mononitrate，ISMN）為硝酸異山梨酯的主要活性代謝產(chǎn)物。可通過擴張外周血管，特別是增加靜脈血容量，減少回心血量，降低心臟前后負荷，從而減少心肌耗氧量；同時還可以促進心肌血流重新分布，改善缺血區(qū)血流供應，單硝酸異山梨酯可能通過這兩方面發(fā)揮抗心肌缺血作用。目前國內(nèi)復方單硝酸異山梨酯緩釋片上市不久，為考察其相對生物利用度及了解藥代動力學參數(shù)，本文建立了測定血漿中單硝酸異山梨酯的反相高效液相色譜法。有關血中單硝酸異山梨酯的測定，文獻報道有氣相色譜-電子捕獲法［1～3］，高效液相色譜法［4～6］，而反相高效液相色譜法報道少見。本研究建立簡單、靈敏、準確的RP-HPLC法，可廣泛用于復方單硝酸異山梨酯緩釋制劑生物利用度和藥代動力學的測定以及治療藥物監(jiān)測。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜分析儀，配備G1313A自動進樣器和G1315BDAD檢測器，Agilent色譜工作站。

　　1.2 色譜條件 色譜柱：預柱Ultrasphere C18柱（5 μm，4.6 mm×45 mm），分析柱Ultrasphere C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：甲醇-正己烷-乙腈（90∶6∶4，pH=7.4），流速1.0 mL/min；檢測波長220 nm，靈敏度為0.01 AUFS。

　　1.3 藥品與試劑 單硝酸異山梨酯（河南天方藥業(yè)有限公司）；卡馬西平（中國藥品生物制品檢定所）。乙腈、正己烷為色譜純，甲醇為分析純。

　　1.4 標準溶液 準確稱取單硝酸異山梨酯10.0 mg及卡馬西平10.0 mg，分別置于2個50 ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度即成單硝酸異山梨酯和內(nèi)標卡馬西平貯備液（200 mg/L），-20 ℃保存可穩(wěn)定2個月，臨用時將貯備液用重蒸水稀釋至所需濃度，即得單硝酸異山梨酯系列工作液（8000，4000，2000，1000，500，250，125 μg/L）和內(nèi)標稀釋液（126 μg/L）。

　　2 方法與結果

　　2.1 標準曲線 取正常人空白血漿各0.5 ml共7份，分別加入單硝酸異山梨酯標準系列工作液100 μl，使各管血漿濃度分別為1600，800，400，200，100，50，25 μg/L，再分別加入內(nèi)標稀釋液100 μl，0.25 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl，混勻后用乙醚5.0 ml渦旋混合萃取3 min，離心（2500 r/min）10 min，小心將有機相4 ml移至另一尖底離心管內(nèi)，置于40 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣溶于100 μl流動相，取20 μl進樣。由單硝酸異山梨酯與卡馬西平的峰面積比（Y）對單硝酸異山梨酯濃度（X）作標準曲線，計算得回歸方程為:Y=0.2297＋0.5586 X（r=0.999，n=7），表明在血藥濃度25～1600 μg/L范圍內(nèi)有良好線性關系。

　　2.2 樣品測定 取受試者血漿樣品0.5 ml，加入重蒸水100 μl，按標準曲線制備項下操作，在標準曲線上求出各樣品中單硝酸異山梨酯濃度。

　　2.3 保留時間及檢測限 空白及樣品血漿色譜圖（見圖1）中單硝酸異山梨酯及內(nèi)標卡馬西平的保留時間分別為6.8 min和8.4 min（分離度為2.0）。單硝酸異山梨酯的最低檢出量為2 ng，最低檢出濃度為10 μg/L（以信噪比≥3計）。

　　2.4 方法精密度 取含單硝酸異山梨酯高、中、低3種濃度的樣品，于同日內(nèi)連續(xù)測定5次，精密度分別為1.5%、2.06%、3.10%；4日內(nèi)重復測定5次，精密度分別為3.61%、3.98%、4.27%。

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