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外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測在前列腺癌診斷中的臨床應用
作者：辛華 馬雷 高英英 郭宇航 孫玉鴻 江清林 劉國輝【摘要】 目的 探討利用外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測診斷前列腺癌（PCa）的臨床應用及意義。方法 運用酶聯(lián)免疫分析和巢式RT?PCR檢測22例PCa、10例良性前列腺增生（BPH）患者，5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSA mRNA的情況。結果 PCa患者血清PSA的水平與臨床分期、Gleason評分有關（P＜0?05），而與年齡無關（P＞0?05）；外周血PSA、PSA mRNA與臨床分期、內分泌治療有關（P＜0?05），而與年齡、Gleason評分無關（P＜0?05）；22例PCa標本中PSA mRNA陽性表達15例，陽性率68%，10例BPH和10例陰性對照標本無表達。結論 利用外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測是一種早期發(fā)現(xiàn)PCa微轉移，判斷其臨床變化過程、分期、預計復發(fā)和評價療效的方法。
【關鍵詞】 前列腺特異抗原；前列腺癌；前列腺增生；逆轉錄聚合酶鏈式反應
臨床上大約有50%的前列腺癌(PCa)病人在確診時就已經發(fā)生了轉移,病變已屬晚期，預后不良〔1～3〕。國外報道血清游離PSA與外周血PSA mRNA聯(lián)合檢測PCa在鑒別良、惡疾病上有一定優(yōu)越性〔4，5〕。國內這方面報道較少。應用RT?PCR技術檢測外周血中存在的少量癌細胞，可以發(fā)現(xiàn)微轉移，對腫瘤的復發(fā)、轉移、預后及臨床治療具有指導意義〔6，7〕。本研究采用酶聯(lián)免疫技術和巢式RT?PCR技術聯(lián)合檢測外周血PSA和PSA mRNA，以提高PCa微轉移的診斷效率、監(jiān)測復發(fā)、預測腫瘤分期及預后。
1 材料與方法
1?1 病例資料
PCa組：選擇2005～2006年佳木斯大學附屬第一醫(yī)院、佳木斯市中心醫(yī)院門診和住院病人。22例均為初診PCa患者，均經前列腺穿刺病理診斷，年齡64～82歲，平均72歲。22例PCa患者中有15例接受了內分泌治療，7例未接受。BPH組：10例均為行前列腺經尿道電切術后病理證實患者，年齡34～81歲，平均65歲。陰性對照組：5例男性健康志愿者（檢測前1個月限制性生活）和5例女性健康志愿者，血液學指標均正常，年齡25～45歲，平均38歲。
1?2 儀器及材料
Ficoll淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學科學院天津血液病研究所，總RNA提取RNAiso試劑盒、兩步法RT?PCR試劑盒購自大連生物工程有限公司，引物由上海生物工程服務技術有限公司合成，PSA定量試劑盒購自美國博檢生物試劑有限公司。Biometra Tg PCR 儀：華粵企業(yè)集團有限公司；DU800核酸蛋白分析儀：Beckman公司；免疫分析儀器：DNM9602G型酶標分析儀（北京普朗儀器公司）。
1?3 引物序列
PCR引物：（1）外引物：PSA?494：5’?TACCCACTGCATCAGGAACA?3’；PSA?960：5’?CCTTGAAGCACACCATTACA?3’。（2）內引物：PSA?559：5’?ACACAGGCCAGGTATTTCAG?3’；PSA?894：5’?GTCCAGCGTCCAGCACACAG?3’。β?actin 上游：5’?CGGGAAATCGTGCGTGACAT?3’；下游：5’?GAACTTTGGGGGATGCTCGC?3’。擴增目的片段長度為712 bp。
1?4 血清的提取
抽取空腹靜脈血（各項檢查前）5 ml，立即2 000 r/min離心10 min，分離血清置-20℃保存，1 w內完成實驗。
1?5 外周血單個核細胞的提取
抽取5 ml靜脈血（各項檢查前）肝素抗凝，用Ficoll淋巴細胞分離液分離白細胞置-80℃冰箱保存，提取過程按其說明書操作。
1?6 總RNA的抽提及質量鑒定
用Trizal試劑提取總RNA，提取過程按其說明書操作。提取產物用1?2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質量。紫外分光光度計下測OD260、OD280，測定RNA純度和濃度。取OD260/OD280值在1?8～2?0范圍內的標本進行逆轉錄。所有實驗中的塑料制品及實驗用具均經0?1轕C水處理后高壓滅菌。
1?7 RT?PCR
取1 μg總RNA進行逆轉錄反應；取逆轉錄產物2 μl和PSA上下游外、內引物各1 μl，使用20 μl反應體系進行2次PCR（2次PCR反應體系相同），同時擴增PSA、β?actin和陰性對照cDNA（由健康女性外周血白細胞RNA逆轉錄獲得）。具體循環(huán)參數(shù)為：94℃ 4 min，94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；25個循環(huán)之后，72℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后用EB染色，經凝膠成像系統(tǒng)拍照。
1?8 血清PSA的檢測
PSA定量檢測由專人嚴格按說明書進行操作。
1?9 統(tǒng)計學處理
應用SPSS10?0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用t檢驗、χ2檢驗。
2 結果
2?1 PCa組、BPH組、陰性對照組血清PSA檢測結果 見表1。表1 PCa組、BPH組、陰性對照組血清PSA的檢測結果（略）
2?2 PCa組血清PSA檢測結果與臨床參數(shù)的關系
見表2。表2 PCa組血清PSA與
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