簡述菊粉酶酶源誘變菌株產酶發酵條件的優化試驗
摘要：為提高黑曲霉(Aspergillusniger)A24誘變菌株產菊粉酶的活力，采用單因子試驗方法對該菌株的最佳產酶條件進行了優化。結果表明：該菌株在以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4為復合氮源的培養基中，初始 pH值6.0，30℃培養72h的條件下，所得的發酵液中酶活力最高，達到35.21U/mL，比優化前提高了18%，表明該菌株有一定的應用潛力。
關鍵詞：黑曲霉;菊粉酶;酶活力;發酵條件;優化
傳統果糖的生產一般是由淀粉通過葡萄糖的異構化取得，該法工藝復雜、成本較高、果糖含量低。因此，人們一直在尋求一種廉價的新糖源和生產果糖的方法。其中菊粉酶(Inulinase或Inulase)主要催化水解菊粉中的β-2，1呋喃果糖苷鍵，由于能在溫和條件下水解菊粉產生果糖(70%以上)和少量葡萄糖，只需一步酶解過程，工藝簡單，生產成本低，可直接制備超高果葡糖漿，已成為果糖工業化生產的主要酶制劑，為低聚果糖的生產提供了一個很好的解決辦法。但來源于植物的菊粉酶底物專一性較強，僅作用于菊粉;由微生物產生的菊粉酶大都能水解含有β-2，1呋喃果糖苷鍵的多種糖類，如菊糖、蔗糖和棉子糖等[1]。其中霉菌具有所產菊粉酶的最適溫度較高、熱穩定性好、適宜偏酸性的環境等特點而倍受關注。由濰坊學院生命科學學院實驗室所保存的黑曲霉(Aspergillusniger)A24誘變菌株是從菊芋根際周圍土壤中篩選出的一株產菊粉酶、又經過多輪紫外線誘變獲得的菊粉酶產量較高的菌株。該試驗在此基礎上，對其發酵條件進一步優化，以期獲得更高的產菊粉酶活力，為進一步研究菊粉酶的生產以及生產應用提供理論基矗
1、材料與方法
1.1供試材料
黑曲霉(Aspergillusniger)A24誘變菌株，由濰坊學院生命科學學院實驗室保存。菊芋(HelianthustuberosusL.)采自濰坊市郊區。菊芋汁參照前人研究方法進行制備[2]。
1.2發酵培養條件及發酵液的制備
取0.1mL黑曲霉孢子懸液，接入50mL的YJ(初始培養條件：菊粉2%，酵母膏0.3%，(NH4)2HPO41%，初始pH值6.0)發酵培養液中(250mL三角瓶)，在不同條件下進行發酵培養。
1.2.1不同碳源對產菊粉酶的影響。選擇碳源分別為2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，將黑曲霉A24誘變菌種接入到不同碳源的培養基中，調節各培養基初始pH值為6.0，在30℃、120r/min的條件下培養72h，將各處理的發酵液經8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測定酶活力。并選擇出最優碳源，以1%、2%、3%、4%的添加量研究不同濃度的該最優碳源對產菊粉酶的活力影響。
1.2.2不同氮源對產菊粉酶的影響。用3%的菊芋汁作碳源，以不同種類的復合氮源(有機和無機)制備的培養基發酵培養3d后，測定其發酵液中菊粉酶活力，確定最佳有機氮源;在確定最佳有機氮源為牛肉膏、無機氮源為(NH4)2HPO4的基礎上，進行有機氮源和無機氮源最佳配比試驗。以牛肉膏和(NH4)2HPO4做復合氮源發酵試驗，取質量濃度分別為1%、2%、3%的牛肉膏和質量濃度分別為0.3%、0.5%、0.8%的(NH4)2HPO4進行復合。調培養基初始pH值為6.0，于30℃，發酵培養3d，將各處理的發酵液經8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測定酶活力。
1.2.3培養基初始pH值對產菊粉酶的影響。設培養基初始pH值分別為3、4、5、6、7，以3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、(CNH4)2HPO4為復合氮源，于30℃條件進行發酵培養3d。將各處理的發酵液經8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測定酶活力。
1.2.4發酵溫度對產菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4為復合氮源、初始pH值6.0的發酵培養基，對黑曲霉A24誘變菌株分別在24、26、28、30、32℃下進行發酵培養72h，將各處理的發酵液經8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測定酶活力。
1.2.5發酵時間對產菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4為復合氮源，培養基初始pH值為 6.0，30℃下分別發酵24、48、72、96、120h，每隔24h取樣。將各處理的發酵液經8000r/min離心10min后，收集上清液，測定酶活力。
1.3發酵液中還原糖含量及菊粉酶的活力測定
采用3，5-二硝基水楊酸法測定發酵液中還原糖的含量，在540nm波長處測定吸光度值，根據葡萄糖的標準曲線，求得還原糖的含量;酶活力定義為在規定反應條件下每分鐘轉化底物生成1μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U/mL)，按照Pessoni等人報道的研究方法測定菊粉酶活力 。
2、結果與分析
2.1不同碳源對產菊粉酶的影響
試驗結果表明，以2%菊芋汁為碳源時酶活力最高，為12.33U/mL;菊粉次之，為10.18U/mL;葡萄糖、果糖為碳源時酶活力較低，均在 2.5U/mL以下。進一步分析不同濃度菊芋汁為碳源對產菊粉酶的影響，發現菊芋汁濃度為3%時，菊粉酶活力最高，為11.18U/mL。
2.2不同氮源對產菊粉酶的影響
研究結果表明，復雜有機氮源比簡單無機氮源有利于菊粉酶的產生，且最適有機氮源為牛肉膏，無機氮源為(NH4)2HPO4，2種氮源所得到的菊粉酶活力分別為14.14、8.64U/mL。由表1可以看出，復合氮源比單純有機或無機氮源更有利于菊粉酶的產生，且當牛肉膏和(NH4)2HPO4的質量濃度分別為2%和0.5%時，菊粉酶活力最高，為19.98U/mL。
2.3培養基初始pH值對產菊粉酶的影響
檢測不同初始pH值對黑曲霉A24誘變菌株產菊粉酶的影響，結果如圖1所示�？梢钥闯�，在初始pH值為3~6的范圍內，隨著pH值升高，菊粉酶酶活增強，pH值為6.0時產菊粉酶酶活最高，達到28.83U/mL。此后隨著pH值升高，菊粉酶酶活明顯下降。
2.4發酵溫度對產菊粉酶的影響
試驗結果表明，在24~30℃范圍內，隨著培養溫度升高菊粉酶酶活增強，30℃時產菊粉酶酶活最高，為32.51U/mL。此后，隨著溫度升高，菊粉酶酶活明顯下降，說明菊粉酶對溫度比較敏感。因此，30℃是黑曲霉A24誘變菌株產菊粉酶的最適溫度(圖2)。
2.5發酵時間對產菊粉酶的影響
可以看出，隨發酵時間的增加，黑曲霉A24誘變菌株產菊粉酶活力增強，在培養72h后產菊粉酶酶活最高，為35.21U/mL。此后，隨著發酵時間延長，菊粉酶酶活有下降趨勢。
3、結論與討論
近年來，利用微生物產菊粉酶已有不少報道，包括真菌中的黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicilliumsp.)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)以及細菌中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和假單孢菌(Pseudononassp.)等[5]，其中黑曲霉由于特性穩定、易于培養而受到格外關注，并被普遍用來發酵生產菊粉酶。王靜等[6]對一株黑曲霉 JNSP5-06產菊粉酶的發酵條件進行了優化，得到最佳優化條件：2%菊粉，2%酵母膏和0.5%NH2PO4，初始pH值6.5，30℃培養96h，優化后的最佳產菊粉酶活力達到29.73U/mL;唐艷斌等[7]曾報道黑曲霉菌株SYS-1在菊粉2%、(NH4)2HPO42%、初始pH值6.0、 30℃培養96h的發酵條件下產菊粉酶酶活最高，達到59.25U/mL。而該試驗確定的黑曲霉A24菌株產菊粉酶的最適發酵條件為：菊芋汁3%、牛肉膏 2%、(NH4)2HPO40.5%、初始pH值6.0，30℃培養72h。在此條件下，黑曲霉A24誘變菌株發酵液中菊粉酶活力最高，為 35.21U/mL。試驗所確定的最適氮源與王靜等[6]的結果不一致，培養時間比上述報道縮短了24h，可能是因為不同菌株間存在一定差異所致，但該試驗結果明顯能減少成本，在生產中的應用潛力更大。
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