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      NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影響

      時間:2024-07-15 17:18:22 藥學畢業論文 我要投稿
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      NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影響

      【摘要】 研究日本新近研制的第三代3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA)還原酶抑制劑匹伐他汀(pitavastatin, NK-104)對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影響。方法:采用細胞培養技術,以肝癌細胞系HepG 2為靶細胞,以不同濃度的藥物處理細胞48 h后,利用WST-8法測定NK-104對細胞增殖的影響;利用熒光染料Hoechst 33258染色,熒光顯微鏡觀察細胞核碎片;以流式細胞儀分析細胞周期的變化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法檢測caspase-3活性。結果:NK-104(10 μmol/L)對HepG 2細胞有明顯抑制作用,可誘導HepG 2細胞凋亡,并能增強caspase-3基因的活性。結論:NK-104能夠誘導HepG 2細胞凋亡,其機制與caspase-3依賴性凋亡調節信號通路有關。
      【關鍵詞】 肝癌
       3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA)還原酶抑制劑,統稱為抑制素,是重要的脂類合成抑制劑,主要在人體肝臟中代謝,臨床上廣泛應用于治療高脂血癥[1]。 最近研究發現,HMG-CoA還原酶抑制劑具有生物學多效性,與降血脂無關。有報道其在體外具有抗癌作用[2]、體內與5氟尿嘧(fluorouracil, 5-Fu)共同作用能夠延長晚期肝癌患者的生存期[3]。匹伐他。╬itavastatin, NK-104)是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA還原酶抑制劑[4]。在血管內皮細胞系NK-104通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K-Akt)基因激活途徑對內皮細胞的保護作用已有報道[5],但其在肝癌細胞系的抗癌作用尚未見報道。本文在肝癌細胞系HepG 2通過2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二硫代苯)-2H-四氮唑單鈉鹽 {[2-(2-methoxy-4-nitrophe-nyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt], WST-8}、熒光染料Hoechst33258染色、流式細胞儀和半胱氨酸蛋白酶3比色法等檢測方法,研究NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影響,為NK-104在抗腫瘤中的作用機制提供實驗依據。
        1 材料和方法
        1.1 主要材料與儀器 NK-104,日本興和有限公司(日本名古屋)和日產化學工業公司(日本東京)產品;熒光染料Hoechst 33258、甲羥戊酸( mevalonic acid, MEV)和碘化丙(propidium iodide, PI)染色液(PI 100 g/L, 1% Triton 100, 9 g/L NaCl),Sigma公司產品。流式細胞儀,2000 FCA,美國BD公司產品。
        1.2 實驗方法
        1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞株HepG 2(美國ATCC公司產品)在含10%胎牛血清的DMEM培養基、5% CO2、37 ℃條件下培養。實驗中,細胞種植于適當培養皿中,90%的細胞融合時,用磷酸鹽緩沖液洗凈后,加入適量含有NK-104和MEV( 1 mmol/L )等藥物的培養液,37 ℃培養箱中培養。
        1.2.2 WST-8方法 利用WST-8試劑盒對細胞增殖進行測定。HepG 2細胞(1×104個細胞/孔)接種于含100 μl培養液的96孔培養板中,NK-104( 0.1 ~100 μmol/L)治療48 h后,分別加入WST-8試劑10 μl(日本同仁化學研究所)培養2 h后,選擇450 nm波長,測定各孔的吸光度OD值。
        1.2.3 Hoechst 33258染色 細胞經藥物刺激 48 h 后,甲醇-冰乙酸(3∶1)細胞固定液4 ℃固定5 min,磷酸鹽緩沖液稍洗后,點加Hoechst 33258染色液, 10 min 。用濾紙沾去多余液體,封片劑封片后熒光顯微鏡觀察細胞核碎片。
        1.2.4 流式細胞儀檢測凋亡峰 在室溫下將刺激48 h后的細胞用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次,并在適當的染色緩沖液中吸取100 μl的細胞(1×105)至試 管中。加入200 μl RNase A,37 ℃水浴30 min,再加800 μl PI染色液混勻,4 ℃避光30 min后,立即上機分析。
        1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 經藥物治療 48 h 后收集細胞,采用半胱氨酸蛋白酶3比色法試劑盒按照廠家說明進行測定(Medical

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