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尿毒癥患者血清對小鼠骨髓紅系祖細胞集落形成影響的研究
作者：孫倩美 劉敬偉 陳向東【關鍵詞】 尿毒癥
【摘要】 目的 本文采用甲基纖維素細胞培養的方法，分析尿毒癥患者血清對小鼠骨髓紅系祖細胞集落形成的影響，初步探討紅細胞生成抑制因子的存在。方法 選擇12例尿毒癥腎性貧血未透析患者為試驗組，另選正常健康體檢者12例為正常對照組，將實驗組、正常對照組血清分別稀釋成不同終濃度，采用甲基纖維素細胞培養的方法對小鼠骨髓細胞進行培養，對比不同濃度血清組紅系集落形成單位（CFU-E）、紅系爆式形成單位（BFU-E）的集落數。結果 在實驗組中，與血清濃度為0的濃度組相比，與各濃度組血清共同培養的小鼠骨髓CFU-E和BFU-E的集落數均明顯減少，且隨血清濃度的增加，小鼠骨髓CFU-E和BFU-E的集落數逐漸減少，各濃度組間差異有顯著性（P＜0.05）。結論 尿毒癥患者血清抑制小鼠骨髓紅系祖細胞集落形成，隨患者血清濃度的增加，抑制作用增強，具有劑量依賴性。
【關鍵詞】 尿毒癥；貧血；紅系祖細胞；集落形成單位測定
【Abstract】 Objective To investigate the existence of the erythropoiesis inhibitors （EI）.Methods The present study included twelve undialyzed ESRD patients with anemia.The sera from the uremic patients were added to CFU-E and BFU-E culture in the concentrations ranging from 1.25% to 5%.In vitro CFU-E and BFU-E growth in the presence of sera from ESRD patients was compared with in the presence normal human subjects with the use of normal mice bone marrows.Results The effects of the sera from uremic patients on CFU-E and BFU-E colony growth in concentrations ranging from 1.25% to 5% were investigated to be dose-dependent.The effect increased with the concentrations increasing of the sera（P＜0.05）.There were not significant inhibitory effect on the CFU-E and BFU-E growth of mice bone marrow in vitro from sera of the normal subjects.Conclusion The erythropoiesis inhibitors exist in uremic sera which has a dose-dependent inhibitive effects on the growth CFU-E and BFU-E of normal mice bone marrow cells.
【Key words】 uremia;anemia;erythroid progenitor cell;colony-forming units assay
貧血是尿毒癥常見的并發癥之一，嚴重影響患者的生活質量和疾病的預后。紅細胞生成素（EPO）缺乏是尿毒癥貧血的主要原因，但應用人基因重組紅細胞生成素（rHu-EPO）治療仍有20%~30%左右的患者療效不佳［1］。目前的研究顯示，一些尿毒癥患者血EPO濃度并不下降，而是正常甚至高于正常，提示尚有其他重要因子參與腎性貧血的機制［2，3］。有研究表明，尿毒癥患者血清能抑制骨髓紅系祖細胞生長，充分透析增加毒素的消除，可改善尿毒癥的貧血、提高rHu-EPO的療效，所以提出了尿毒癥某些毒素可能是紅細胞生成抑制因子。但不同的研究小組獲得的實驗結果也存在爭議。因此，近年來有關尿毒癥紅細胞生成抑制因子是否存在又引起學者們的關注，但目前仍沒有達成共識。本文通過觀察尿毒癥患者血清對小鼠骨髓紅系祖細胞集落形成的影響，初步探討紅細胞生成抑制因子是否存在。
1 對象與方法
1.1 實驗對象 選擇12例尿毒癥腎性貧血未透析患者為實驗組，原發病為慢性腎炎8例、高血壓腎動脈硬化2例、慢性腎盂腎炎2例，其中男5例，女7例。患者平均年齡（50±12）歲，Cr范圍8.2~14.7mg/dl，BUN范圍83~135mg/dl。入選病例均無慢性炎癥（C-反應蛋白水平正常），無血液系統疾病或腫瘤，無鐵缺乏（血清鐵蛋白＞100ng/ml）。患者在實驗前均無輸血史，未使用過rHu-EPO、鐵劑，實驗前一個月未使用過ACEI。另選正常健康體檢者12例設為對照組，男6例，女6例，平均年齡（48±14）歲。
1.2 實驗方法
1.2.1 標本采集與保存 實驗組及對照組受試者均于清晨空腹抽取靜脈血，室溫靜置30min后離心，分離血清，56℃加熱滅活30min，-80℃冰箱保存備用。
1.2.2 小鼠骨髓細胞紅系集落形成單位（CFU-E）、紅系爆式形成單位（BFU-E）的培養 取8~10周Bal-c小鼠（均由軍事醫學科學院實驗動物研究所提供）。小鼠擊頭處死，75%酒精浸泡20min。立即無菌取出雙側骨髓，用IMDM培養液沖出全部骨髓細胞，臺盼藍染色進行細胞計數，并用IMDM培養液調整細胞密度為1×105/0.2ml（活細胞率＞95%）。
1.2.3 培養體系和條件 2.7%甲基纖維素，IMDM培養液，10-4mol/L巰基乙醇，15%小牛血清，3%谷氨酰胺，EPO（2u/0.2ml），CSF（50ng/ml），IL-3（10ng/ml）。將混勻的體系分別加到兩個30mm培養皿中，加蓋后放入37℃、飽和濕度的5%CO2培養箱內。培養第3天，聯苯胺染色后倒置顯微鏡下計數含8個以上染色陽性的細胞集落為CFU-E。培養第7天，計數含50個以上染色陽性的細胞集落為BFU-E。
1.2.4 實驗方法 將實驗組、對照組血清分別用IMDM培養液稀釋成終濃度為0（用等量培養液代替血清，作為陰性對照）、1.25%、2.5%、5.0%，觀察兩組不同濃度血清對小鼠骨髓CFU-E、BFU-E集落生長的影響。
1.3 統計學方法 所有數據均以均數±
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