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HBV全基因組克隆轉染細胞系的建立
作者：趙艷芳，閆永平，蘇海霞，王安輝，張磊，張景霞，門可，徐德忠【關鍵詞】 肝炎病毒,乙型；基因組,病毒；克隆,分子；轉染；細胞培養；基因表達
【Abstract】 AIM: To construct a new cell culture system for producing HBV in vitro.METHODS: Fulllength HBV DNA was cloned into pcDNA3 vector (named pcDNA33HBV). HepG2 cells were transfected with pcDNA33HBV and screened with antibiotic G418. HBsAg and HBeAg were identified by ELISA and HBcAg was identified by immunocytochemical staining. S gene mRNA expression was tested by RTPCR and HBV DNA in the supernatant of transfected cells was tested by PCR. RESULTS: The plasmid pcDNA33HBV was constructed successfully. After stable transfection, HBsAg and HBeAg could be detected in the supernatant of transfected cells. HBcAg positive staining was located mainly in the cytoplasm. S gene mRNA expression was verified. S gene and preS gene could be detected in the supernatant by RTPCR. The copies of HBV genome can reach 1×108 copies/L detected by realtime quantitative PCR. CONCLUSION: Recombinant plasmid pcDNA33HBV could be expressed, transcribed and replicated in HepG2 cells. This transfectionbased cell culture system could produce high copies of HBV genome.
【Keywords】 hepatitis B virus; genome, viral; cloning, moleculor; transfection; cell culture; gene expression
【摘要】 目的： 建立HBV體外細胞培養體系. 方法： 構建HBV全基因克隆質粒pcDNA33HBV，穩定轉染HepG2細胞，G418篩選. ELISA檢測細胞上清液HBsAg，HBeAg的表達，免疫組化檢測細胞內HBcAg的表達，RTPCR檢測細胞S基因mRNA的表達，PCR檢測細胞上清液DNA. 結果： 成功構建了HBV全基因克隆質粒pcDNA33HBV，穩定轉染HepG2后，培養上清HBsAg，HBeAg陽性，細胞內HBcAg呈核漿型分布，且以漿型分布為主. RTPCR證實有HBV S基因 mRNA 的表達，上清中HBV S及前S基因陽性，熒光定量PCR檢測顯示培養上清中HBV 滴度達1×108拷貝/L. 結論： 重組質粒pcDNA33HBV能在HepG2細胞中表達、轉錄、復制，該細胞培養體系能產生較高水平的HBV.
【關鍵詞】 肝炎病毒，乙型；基因組，病毒；克隆，分子；轉染；細胞培養；基因表達
0引言
由于HBV宿主范圍窄、動物模型缺乏，體外組織培養也一直沒有太大進展，且不能在體外人工培養，制約了對HBV的研究［1］. 將HBV DNA轉移至靶細胞，建立表達HBV的體外培養細胞模型對研究HBV生物學特性和肝炎發病機制有重要意義［2-4］. HBV基因組呈雙鏈閉合環狀，基因結構緊湊，其開放讀框分布于全長DNA，為使完整的轉染基因能在細胞內復制，目的基因的長度要大于一個HBV DNA單元［5-6］. 我們構建3倍HBV基因的重組真核表達質粒，轉染細胞，以篩選獲得穩定表達病毒蛋白的細胞模型，并研究其產生HBV的水平.
1材料和方法
1.1材料HBV全基因亞克隆載體pUC193HBV為pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位點中插入頭尾相連的HBV（adr亞型）三連體，由山東大學醫學院免疫學研究所張秋博士惠贈，保存在大腸桿菌DH5α中. 真核細胞表達載體pcDNA3由第四軍醫大學生物化學與分子生物學教研室趙晶博士惠贈；人肝母細胞瘤細胞系（HepG2）由第四軍醫大學微生物學教研室惠贈，本室傳代培養；內切酶EcoRⅠ, HindⅢ, T4 DNA連接酶,Taq DNA聚合酶,反轉錄酶及DNA marker（TakaRa公司）；質粒提取試劑盒（西安市萊博科技發展有限公司）；LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）；DMEM培養基，G418（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；ELISA檢測試劑盒（上海科華
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