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簡便有效分離培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的一種新方法
畢業(yè)論文作者：肖瓊 房云�！⌒焯N 田鏵 張立平 田興松
【摘要】 目的：探索分離、培養(yǎng)鼠主動脈內(nèi)皮細胞的有效方法。方法：將鼠主動脈內(nèi)膜翻向外，結(jié)扎兩端，置于50 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)、傳代，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)染色。結(jié)果：培養(yǎng)6～8 d 時有少量細胞自主動脈遷移出并貼壁生長；12～14 d 時貼壁細胞覆蓋大部分培養(yǎng)瓶面，約80%的細胞匯合成單層；傳代細胞生長旺盛；細胞匯合后呈現(xiàn)典型的“鵝卵石”樣內(nèi)皮細胞特征，內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Ⅷ因子相關(guān)抗原表達陽性；未見雜細胞。結(jié)論：此方法無損傷、不需要酶消化，能比較容易的獲得高純度大鼠原代主動脈內(nèi)皮細胞，適用于細小血管內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)。
【關(guān)鍵詞】 主動脈·體外培養(yǎng)·內(nèi)皮細胞·大鼠
A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
內(nèi)皮細胞是研究心血管、炎癥、腫瘤等疾病最常用的工具。目前，對臍靜脈等較大血管原代內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)1般采用酶消化法，技術(shù)已經(jīng)成熟。但對于大鼠等小動物血管而言，由于管徑細小，操作難度大，其內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)1直存在產(chǎn)量少、易混入雜細胞等問題 ［1］。本研究經(jīng)過反復(fù)實驗，建立了1種有效獲取高純度、高數(shù)量大鼠原代血管內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)方法。
1 材料與方法
1.1 實驗材料 4周齡Wistar 大鼠10只，均為雌性，體質(zhì)量140～160 g（購自山東大學(xué)動物實驗中心），縫衣針，手術(shù)縫合線，胎牛血清（HyClone，購自美國），DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco，購自美國）。
1.2 培養(yǎng)方法
1.2.1 大鼠主動脈的原代培養(yǎng) 取Wistar 大鼠1只，無菌條件下打開腹腔和胸腔。截取主動脈約3 cm,放入含有青霉素105 U/L、鏈霉素100 mg/L的D-Hanks液中，用吸管將動脈管腔殘留的血液沖洗干凈。縫衣針去尖,牽引手術(shù)縫合線穿過主動脈管腔，縫合線的遠端就近結(jié)扎動脈的1端，血管鉗牽引縫合線近端，同時用鑷子輕輕反向下滑動脈，使主動脈內(nèi)膜翻出，折入縫扎動脈的另1端，此時翻過來的動脈兩端被完全折入封閉。將動脈置于50 mL培養(yǎng)瓶中，加入含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液，液體僅遮蓋主動脈即可，置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，3 d 換液1次。
1.2.２ 細胞傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)約12 ～14 d，遷出生長的細胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上，約80 %的細胞匯合即可傳代。取出主動脈，用D-Hanks液沖洗培養(yǎng)瓶2次，常規(guī)消化、吹打，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液適量，制成細胞懸液，依照細胞的量按1：1或1：2傳代培養(yǎng)，3 d換液1次。另9只大鼠以同樣步驟重復(fù)上述實驗。
1.3 免疫細胞化學(xué)鑒定 在24孔培養(yǎng)板內(nèi)放置無菌蓋玻片，每孔種植1 mL 含有104個細胞的懸液，待細胞生長至接近匯合時,取出蓋玻片，室溫下4%的多聚甲醛固定10 min,常規(guī)SABC法顯示血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Ⅷ因子相關(guān)抗原（vWF）。
1.4 細胞純度分析 取6次培養(yǎng)的第2代主動脈內(nèi)皮細胞，vWF免疫細胞化學(xué)染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機選5個視野計數(shù)細胞，計算細胞陽性表達率（細胞陽性表達率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）。
2 結(jié)果
2.1 形態(tài)學(xué) 原代培養(yǎng)6～8 d，在動脈附近可見少量的細胞遷出并貼壁生長，細胞呈短梭形或多角形。培養(yǎng)至12 ～14 d，遷移出生長的細胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上，密度不勻，其中約80 %的細胞匯合成單層，呈現(xiàn)內(nèi)皮細胞典型的“鵝卵石”樣特征（圖1）。傳代培養(yǎng)的細胞0.5 h開始貼壁，2 h后約90 %的細胞貼壁，4 ～5 d時細胞匯合成單層。培養(yǎng)至9代時，細胞質(zhì)內(nèi)有空泡出現(xiàn)，同時出現(xiàn)胞體瘦小，細胞呈現(xiàn)老化狀態(tài)。
2.2 免疫細胞化學(xué)染色 vWF免疫細胞化學(xué)染色，細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色陽性反應(yīng)。每張蓋玻片100倍鏡下隨機選10個視野進行觀察，均未見染色陰性表達細胞（圖2）。
2.3 細胞純度分析 vWF免疫細胞化學(xué)染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機選5個視野計數(shù)細胞，所見細胞均為陽性染色細胞，陽性表達率為100%，即獲取的內(nèi)皮細胞純度為100%。
重復(fù)實驗10次，均獲得同樣結(jié)果。
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3 討論
血管內(nèi)皮細胞的原代分離與培養(yǎng)是研究其分子生物學(xué)特性及相關(guān)疾病的重要前提，大鼠是最常用的實驗動物之1。長期以來，由于大鼠血管細小，操作難度大，其血管內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)尚缺乏理想的手段。鼠主動脈內(nèi)皮細胞多采用酶消化法［2-3］和植塊法［4－6］。
酶消化法可以在相對短的時間內(nèi)獲取細胞。大鼠主動脈較細，本實驗發(fā)現(xiàn)150 g的大鼠主動脈管徑約2 mm，其分支非常細且不易結(jié)扎，灌注的酶消化液容易經(jīng)其分支滲漏至管外，使外膜也被消化，導(dǎo)致其他細胞混入；細胞產(chǎn)量亦較低，且大多需同時獲取多條動脈，操作復(fù)雜；有時因酶的活性改變而使消化時間難以掌控,不僅影響內(nèi)皮細胞的分離和提取，亦可直接影響內(nèi)皮細胞的活力［7］。
組織塊移植培養(yǎng)法操作簡單，對細胞活力無損傷，缺點為長出的細胞成分比較復(fù)雜，內(nèi)皮細胞純度低［8］，常伴有成纖維細胞污染。由于成纖維細胞生長迅速，最終過度生長甚至覆蓋內(nèi)皮細胞而影響內(nèi)皮細胞增殖。有學(xué)者將大鼠主動脈外膜做瞬間熱處理后再進行植塊培養(yǎng)，提高獲取內(nèi)皮細胞的純度至67.8%［6］。
本研究采取將大鼠主動脈內(nèi)膜翻向外、兩端內(nèi)折結(jié)扎后直接培養(yǎng)的方法獲取血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)接觸性抑制的“鵝卵石”樣特征，其標(biāo)志物vWF表達陽性，未發(fā)現(xiàn)雜細胞等，提示獲得了數(shù)量可觀的單1的血管內(nèi)皮細胞。本研究采用10只大鼠重復(fù)實驗，均獲得了同樣的結(jié)果，證明該方法具有可重復(fù)性。此方法的優(yōu)勢在于：1）獲取的血管內(nèi)皮細胞純度高、數(shù)量多。由于血管兩端內(nèi)折結(jié)扎，整段血管僅內(nèi)膜接觸培養(yǎng)瓶，外膜面的細胞不易遷出，經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色未發(fā)現(xiàn)vWF陰性細胞，有效避免了血管壁其他細胞的混入。1只大鼠的主動脈即可產(chǎn)出5×105個原代內(nèi)皮細胞，細胞產(chǎn)出量相對較高，經(jīng)傳代培養(yǎng)，可以滿足基本實驗需要。2）對細胞無損傷。內(nèi)皮細胞是1種比較嬌嫩的細胞。本實驗方法無需酶消化，避免了酶消化過程中對細胞的破壞作用，同時節(jié)省了酶灌注和消化時間，操作時間短，有效保護了內(nèi)皮細胞的活力。3）降低實驗費用。胰酶廉價、活性強，但對細胞的損傷大，因此多選用對細胞損傷少的膠原酶,但其價格昂貴。本實驗不需要酶消化，降低了實驗費用。4）操作過程簡便、快捷，減少了細胞被污染的幾率。
此方法解決了鼠主動脈內(nèi)皮細胞難獲取的問題，也適用于其他較大動物細小血管內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)，為進1步研究其內(nèi)皮細胞的生物學(xué)特性及其相關(guān)疾病提供了良好平臺。
【參考文獻】
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［8］ Nicosia RF, Villaschi S, Smith M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1994, 30A（6）:394-399.
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