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HPLC法測(cè)定乙肝清熱解毒片中兩種黃酮類成分的含量教育論文
【摘要】
目的 建立以高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定乙肝清熱解毒片中兩種黃酮類成分（槲皮素、山奈素）含量的方法。方法 色譜柱為伊利特-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60），檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量為20μl，柱溫為35℃。結(jié)果 槲皮素、山奈素檢測(cè)濃度的線性范圍分別為4.2～25.2μg/ml（r=0.9994）、0.97～5.82μg/ml（r=0.9996）；平均回收率分別為97.56%，98.76%，RSD分別為1.62%，1.52%。結(jié)論 本法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于乙肝清熱解毒片的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】
乙肝清熱解毒片 色譜法 高壓液相 槲皮素 山奈素 質(zhì)量控制
乙型肝炎病毒攜帶者，癥見黃疸（或無黃疸）、發(fā)燒（或低燒）、舌質(zhì)紅、舌苔厚膩、脈弦滑數(shù)、口干苦或黏臭、厭油、胃腸不適等。乙肝清熱解毒片是由虎杖、茵陳、北豆根、白花蛇舌草、甘草、拳參等制成，用于肝膽濕熱型急、慢性病毒性乙型肝炎初期或活動(dòng)期的治療。其中白花蛇舌草為重要組成成分，其活性成分黃酮類化合物有清熱、解毒、活血、利尿的功效，可用于治療各種癌癥及炎癥［1］。乙肝清熱解毒片中黃酮類化合物的含量測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道少見，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定乙肝清熱解毒片中槲皮素、山奈素的含量，為評(píng)價(jià)乙肝清熱解毒片的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。
1 儀器與試藥
美國(guó)Agilent HP1100系列高效液相色譜儀（包括Agilent G1310A單元泵、Agilent G1316A柱溫箱、Agilent G1314A可變波長(zhǎng)檢測(cè)器）；威馬龍工作站；TDX高速離心機(jī)（美國(guó)Abbott公司）；電子精密天平(Ohaus)；KS1500超聲清洗器(寧波科勝儀器廠)。
槲皮素、山奈素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：100081-200406，l10861-200304）；乙肝清熱解毒片（山東海森藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20070201，20070501，20070604）；乙腈、甲醇為色譜純；水為雙蒸水；其他試劑為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱：伊利特-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60）；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μl。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥12h的槲皮素、山奈素對(duì)照品適量，加甲醇制成含槲皮素1.05mg/ml、山奈素0.2425 mg/ml的混合對(duì)照品貯備液，備用。取混合對(duì)照品貯備液0.08ml于10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備
取乙肝清熱解毒片20片，研細(xì)，精密稱取粉末約5g，置燒瓶中，加入甲醇20ml和鹽酸1ml，搖勻，置水浴中加熱回流2h，迅速冷卻到室溫，濾過，濾液轉(zhuǎn)移入25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即可。
2.4 陰性樣品溶液的制備
取不含白花蛇舌草的空白片，按“2.3”項(xiàng)下方法制備不含白花蛇舌草的陰性樣品溶液。
2.5 專屬性試驗(yàn)
分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明空白溶液色譜圖在槲皮素、山奈素保留時(shí)間處未顯示色譜峰，專屬性良好。色譜見圖1。
2.6 線性關(guān)系考察
分別精密吸取對(duì)照品貯備液0.04、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20、0.24ml于10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成系列對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以峰面積（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得槲皮素、山奈素的回歸方程分別為A=62498C+4392（r=0.9994）、A=67443C+3071.7（r=0.9996）。結(jié)果表明：槲皮素、山奈素檢測(cè)濃度線性范圍分別為4.2～25.2μg/ml和0.97～5.82μg/ml。
2.7 精密度試驗(yàn)
取對(duì)照品溶液20μl，于室溫下放置0、2、4、6、8、24h后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果槲皮素、山奈素的RSD分別為0.69%、0.50%，表明日內(nèi)精密度良好。取同一份對(duì)照品溶液于0、1、2、3、4天測(cè)定，結(jié)果槲皮素、山奈素的RSD分別為0.78%、0.62%，表明日間精密度良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取供試品溶液（批號(hào)：20070501）于0、2、4、6、8、24h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果槲皮素、山奈素的RSD分別為0.83%、1.10%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。
2.9 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取已知含量的樣品5g，加入一定量的槲皮素、山奈素對(duì)照品，按供試品溶液制備方法操作，得加樣回收測(cè)定溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表1。表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（略）
2.10 樣品含量測(cè)定
分別取3批乙肝清熱解毒片，同“2. 3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表2。表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（略）
3 討論
3.1 本實(shí)驗(yàn)采用甲醇提取與鹽酸甲醇提取進(jìn)行比較，結(jié)果經(jīng)鹽酸甲醇提取的槲皮素、山奈素含量明顯高于甲醇提取。故選擇鹽酸甲醇水解法。
3.2 文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素的檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm［2］和370nm［3］，本實(shí)驗(yàn)取對(duì)照品甲醇溶液，以甲醇為空白，自200～450nm作紫外線掃描，在370nm處均有最大吸收，且峰頂延緩。故選370nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
3.3 通過對(duì)不同甲醇—0.2%磷酸比例的流動(dòng)相進(jìn)行選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈素保留時(shí)間隨甲醇濃度增大而縮短，加入適量乙腈能達(dá)到更好的分離效果，選擇乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60）為流動(dòng)相，分析時(shí)間適中，且樣品中槲皮素、山奈素達(dá)到良好的分離。
3.4 采用水浴加熱回流提取與超聲提取進(jìn)行比較，結(jié)果水浴加熱回流提取槲皮素、山奈素含量明顯高于超聲提取，說明加熱更有利于糖苷的水解。
3.5 黃酮類成分在HPLC測(cè)定中易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，在流動(dòng)相中加入酸類可有效抑制拖尾，提高其峰形的對(duì)稱性，經(jīng)多次測(cè)定，系統(tǒng)具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
【參考文獻(xiàn)】
［1］張海娟，陳業(yè)高，黃榮.白花蛇舌草黃酮成分的研究［J］.中藥材，2005，28（5）：385-387.
［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：257.
［3］孫也之，王琳，劉振，等.高效液相色譜法測(cè)定白花蛇舌草中槲皮素的含量［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（1）：5-6.
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