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淺析藍藻生物工程
[論文關鍵詞];藍藻生物；系統(tǒng)分類；反應過程
[論文摘要];文章對藍藻生物工程進行了研究和分析，希望有助于改善我們對相關問題認識和理解。
藍藻也稱藍細菌，是一種形態(tài)結構簡單卻特殊并且種類繁多、分布廣泛的原核生物。藍藻約有150屬,2000多種。多數(shù)藍藻及其提取物對人畜無毒,因此可成為物品、化妝品、食品飼料以及其它許多重要物質(zhì)的來源。
因此，對水華生物的準確鑒定、快速檢測和預警預報已成為當前水華研究領域的熱點問題，并具有重要的理論和實際意義。傳統(tǒng)的藻類學鑒定方法是通過形態(tài)學的觀察來劃分的,形態(tài)學標準往往使檢測樣本中的一些種不能被辨別出,在水華發(fā)生的過程中,細胞的外型,產(chǎn)毒能力會發(fā)生變化,即使是在實驗室培養(yǎng)條件下,不同氮源藍藻的外形也會發(fā)生變化。目前各種新的檢測技術在逐步建立,已有檢測水華藍藻產(chǎn)毒特性的全細胞PCR檢測法以及依據(jù)16S rDNA基因保守區(qū)域設計引物用PCR方法檢測藍藻和微囊藻存在的報告。
1. 藍藻系統(tǒng)分類研究
傳統(tǒng)的藍藻分類和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立是基于對其表型的比較分析，然而表型是基因和相互作用的結果，基因型相同的個體在不同的環(huán)境下可能表現(xiàn)出顯著的表型差異，因此傳統(tǒng)的分類方法可能受環(huán)境影響，而給分類和系統(tǒng)發(fā)育研究帶來不確定性。分子系統(tǒng)學就是避開生物形態(tài)結構差異的干擾，直接通過檢測生物體內(nèi)大分子所包含的穩(wěn)定遺傳信息，定量描述、分析這些信息在分類、系統(tǒng)進化和遺傳多樣性研究上的作用，從而在分子水平上解釋生物多樣性、系統(tǒng)發(fā)育及進化規(guī)律的一門學科DNA分子作為遺傳信息的直接載體，個體中的每個體細胞都有相同的遺傳信息，因而能較為準確地反映出各個物種問的系統(tǒng)產(chǎn)生關系。根據(jù)DNA序列所含有的遺傳信息來進行分類及系統(tǒng)進化等研究已成為分子系統(tǒng)學研究的一個重要途徑近年來，DNA序列分析廣泛地被用于生物遺傳多樣性分析和生物類群之間存在的種屬關系以及生物類群的系統(tǒng)關系分析。
2. 藍藻基因工程研究
基本分為五大類： 藻類質(zhì)粒和限制內(nèi)切酶研究、 藻類內(nèi)源基因的研究、藻類外源基因的表達、藻類毒素監(jiān)測和藻類監(jiān)測。
目前，已經(jīng)出現(xiàn)檢測水華藍藻產(chǎn)毒特性的全細胞PCR 檢測方法 以及依據(jù)16S rDNA 基因保守區(qū)域設計引物用PCR 方法檢測藍藻和微囊藻存在的報告，以及選取的針對藍藻和微囊藻的16S rDNA 基因保守區(qū)域的特異性引物和針對微囊藻毒素基因 mcyB的一對特異性引物，試圖建立一種可以快速一次性得到這些信息的全細胞多重PCR方法，從而可以為長期大規(guī)模快速監(jiān)測地表淡水水體提供一種有效手段。
3. 藻類基因工程的研究技術及方法
主要分以下三大類：轉移的載體系統(tǒng)、藻類基因克隆的研究、藻類的遺傳轉化
4. 藻細胞基因組DNA提取模板制備
采用早先1988年Porter 的方法，但是這個方法太古早，雖然可行，但是對于多項因素以及雜質(zhì)的干擾，細胞破除
的時間以及獲得的基因的利用度對于中國現(xiàn)狀的實驗來說有待加強。
目前研究人員用于模板制備的方法基本有微波法、CTAB法、SDS法、水浴法等，但是由于地域、選擇的藻類的不同、實驗方法以及目的的不同，研究人員都會在基本實驗方法基礎上稍加改動以優(yōu)化實驗。
5. PCR反應條件以及反應過程
PCR擴增是實驗的關鍵。PCR過程的優(yōu)劣直接關系到實驗成功與否。PCR反應中任何一種因素的變化，都有可能影響擴增結果。PCR擴增條件優(yōu)化主要包括以下幾個方面: 使用對比篩選過的引物令其具有良好的特異性、優(yōu)化的Taq酶濃度、優(yōu)化的Mg2+濃度、優(yōu)化的最佳退火溫度、優(yōu)化的循環(huán)時間、優(yōu)化的循環(huán)次數(shù)。甚至對不同研究目的，不同擴增儀器，不同公司和同一公司不同批次的試劑都應系統(tǒng)的摸索反應條件，優(yōu)化反應體系。最終篩選出PCR擴增的總體最佳條件組合以及排除各種干擾項，并在此相對最佳條件下進行PCR法檢測藍藻的最低限量研究用以確定PCR法的檢測反應靈敏度。
[1]
① Taq酶活力的有無、高低直接關系著擴增結果。Taq酶的用量一般為0.5一3.0U。Taq酶的活力過高可能導致非特異性擴增，過低則酶活不足而導致擴增條帶太弱。
② Mg2+主要作用是作為Taq酶的輔助因子，其濃度過低或過高都會影響Taq酶的活性。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低;濃度過高對酶也有抑制作用。較低的Mg2+濃度擴增有較高的特異性，過高會導致非特異擴增產(chǎn)物的積累，背景模糊。
③ 變性溫度過低，不能使靶基因模板和PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR擴增失敗。變性溫度一般在92一95℃，更高的溫度可能更有效，尤其對富含G一C的片段，但Taq酶在95℃可保持活力35min左右，高溫變性時間過長會導致Taq酶活力降低。
退火溫度決定了反應的特異性。在一定范圍內(nèi)，退火溫度越高，PCR擴增特異性越高;但退火溫度過高，引物與模板DNA親和力太小甚至不能結合，會導致擴增產(chǎn)物量降低。
延伸溫度:現(xiàn)有的Taq酶最佳活力溫度范圍是65一75℃，一般72℃時酶活力最高。因此在擴增反應中，延伸溫度采用72℃。不合適的延伸溫度不僅影響擴增產(chǎn)物的特異性，而目.也會影響其產(chǎn)量。延伸時間取決于靶序列的長度和濃度，延伸時間過長會導致非特異性帶的出現(xiàn)。
④ 循環(huán)次數(shù)決定擴增程度。在其他參數(shù)己優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)次數(shù)取決于靶序列的初始濃度，過多的循環(huán)增加非特異性擴增的數(shù)量和復雜性(平臺效應);循環(huán)次數(shù)太少，PCR產(chǎn)物量就會極低，擴增帶太弱甚至擴增陰性。PCR一般采用25一45個循環(huán)進行擴增
6. PCR擴增時若操作不嚴格，很可能導致假陰性和假陽性結果
假陰性主要是模板液中某些物質(zhì)，如殘留的極少量培養(yǎng)液成分、菌體蛋白等抑制了PCR反應;或者是pCR體系液中某成分失效所致，如dN丁P反復凍融降解、Taq酶活性下降、引物部分降解等都可能導致假陰性的結果。
假陽性的造成，前人認為主要是擴增產(chǎn)物污染和標本間的交叉污染。擴增產(chǎn)物污染既是最嚴重，也是最容易發(fā)生的一種污染。因為經(jīng)過一次標準的PCR擴增，就可以產(chǎn)生大量的擴增產(chǎn)物，即使最微小的氣溶膠微滴(10一6uL)，也可含有大量的靶分子。
由于PCR具有極高的靈敏性，在試驗設計中，研究人員們注意選用較低的Mg2十濃度和引物濃度、較高的退火溫度，可以一定程度上防止非特異性擴增和假陽性的產(chǎn)生。假陽性的原因在于核酸污染，而核酸污染來自兩方面:擴增產(chǎn)物污染以及樣品間DNA交叉污染。目前報導的解決擴增產(chǎn)物污染方法有兩種:尿嗯陡一N一糖基化酶解法和8一甲氧補骨酷素光化學法。但這兩種方法并不能防止樣品間DNA交叉污染。為了盡量避免假陽性的出現(xiàn)，規(guī)范實驗程序可能更有實用價值，從實驗條件到操作上都嚴格要求
參考文獻
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[4] 潘卉,宋立榮,劉永定,朱運芝,沈強. 水華藍藻產(chǎn)毒特性的PCR檢測法[J]. 水生生物學報, 2001,(02).
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